La fórmula
C = A₂₆₀ × factor × dilución
Qué significa
Los ácidos nucleicos absorben al máximo a 260 nanómetros, y en el rango en que se cumple la ley de Lambert-Beer la absorbancia es proporcional a la concentración. La constante de proporcionalidad depende de qué sea la muestra: una absorbancia de 1 corresponde a unos 50 ng/µl de ADN de doble hebra, 40 de ARN y 33 de un oligonucleótido de hebra sencilla. Las proteínas absorben a 280, así que el cociente entre las dos lecturas mide lo limpia que está la preparación.
Cómo calcularlo a mano
- Mide la absorbancia a 260 nm con el blanco del mismo tampón
- Multiplica por el factor del ácido nucleico que estés midiendo
- Multiplica por la dilución si has medido la muestra diluida
- Divide la lectura a 260 entre la de 280 para comprobar la pureza
Lo que conviene saber
La medida solo es fiable con la absorbancia a 260 entre 0,1 y 1: por debajo el ruido manda y por encima el detector se satura, y en los dos casos hay que diluir y volver a medir. Una relación 260/280 en torno a 1,8 es buena para ADN y 2,0 para ARN; por debajo de 1,7 hay proteína o fenol. Y esto mide todo lo que absorbe a 260, no solo lo que te interesa: los nucleótidos libres y el ARN contaminante cuentan igual, así que una concentración alta no significa que el ADN esté íntegro.